O komórkach odpowiedzialnych za powstawanie przerzutów u chorych na raka piersi

Rak piersi jest najczęściej występującym nowotworem u kobiet. Szacuje się, że co roku rozpoznaje się go u blisko 1,7 miliona pacjentek, a ponad 500 tysięcy umiera z jego powodu. W Polsce rak piersi w ostatnim stuleciu stał się jednym z największych zagrożeń powodujących przedwczesną umieralność kobiet. Dr Justyna Topa z Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG i GUMed dodała swoją cegiełkę do badań nad tym nowotworem, zajmując się w pracy doktorskiej krążącymi komórkami nowotworowymi (powodującymi powstawanie przerzutów) o różnych fenotypach u chorych na raka piersi. Za swoją rozprawę doktorską otrzymała Nagrodę Specjalną Rektora „Włączam płeć do badań”.

- Każdego dnia aż 55 Polek słyszy diagnozę: rak piersi. Rocznie zapada na niego ponad 20 tys. kobiet, a ok. 9 tys. umiera.

Dr Justyna Topa: - Rak piersi jest bardzo poważnym i niezwykle częstym globalnym problemem. Statystyki pokazują, że jedna na osiem kobiet w ciągu swojego życia zachoruje na raka piersi. Na szczęście prognoza dla wcześnie zdiagnozowanych chorych jest bardzo obiecująca. Szanse na przeżycie maleją, gdy wystąpią przerzuty odległe.

- Jak powstają przerzuty?

- Przerzuty pochodzą od komórek nowotworowych, które oddzieliły się od guza pierwotnego występującego w piersi, trafiły do krwiobiegu i po znalezieniu przyjaznej niszy mogły się w niej zaadaptować, dzielić i doprowadzić do powstania nowych ognisk nowotworowych. Komórki, które powodują powstawanie przerzutów, były obiektem moich badań w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej. Nazywamy je krążącymi komórkami nowotworowymi (CTCs, circulating tumor cells). Są one bardzo sprytne; potrafią oszukiwać układ immunologiczny, skutecznie się maskując lub wysyłając sygnały, przez które są rozpoznawane jako „niestanowiące zagrożenia”.

- Dlaczego zajęła się Pani właśnie nimi?

- Komórki nowotworowe krążące we krwi mogą być biomarkerem na wczesnym etapie choroby. Już sama obecność tych komórek we krwi chorych daje nam informacje na temat ewentualnego postępu choroby. W mojej pracy doktorskiej skupiłam się przede wszystkim na ich charakterystyce na poziomie mRNA i białka.

- Na czym polegało to badanie?

- W badaniu prospektywnym analizowałam próbki od 104 pacjentek we wczesnym stadium raka piersi, z małymi guzami, bez przerzutów, ale preferencyjnie z zajętymi węzłami chłonnymi.

Moim zadaniem było wyłapywanie CTCs, które na wczesnym etapie choroby są bardzo rzadkie. Wyzwanie stanowiło odsianie miliardów komórek układu immunologicznego i manualne wyizolowanie pojedynczych CTCs, które następnie charakteryzowałam. W jednej próbówce krwi od chorej znajdowałam tylko po kilka, zazwyczaj zaledwie jedną interesującą mnie komórkę. Krwiobieg nie jest naturalnym środowiskiem dla CTCs. Większość z nich przeżywa zaledwie kilka godzin i tylko niewielki odsetek może w przyszłości zapoczątkować przerzut.

- Czyli szukała Pani igły w stogu siana.

- Można tak powiedzieć.

- Bardziej niebezpieczne, czy też bardziej agresywne, stają się te, które przeszły proces przemiany epitelialno-mezenchymalnej, czyli, najprościej mówiąc, zmieniły swój styl życia i ze statycznych stały się ruchliwe, prawda? Ich wędrówka po organizmie może doprowadzić do przerzutu.

- W raku piersi wszystkie komórki nowotworowe na początku są komórkami pochodzenia nabłonkowego - epitelialnego. Komórki nabłonkowe naturalnie tworzą zwarte skupiska, pozostają w ścisłym kontakcie z innymi komórkami oraz z podłożem. W wyniku przemiany epitelialno-mezenchymalnej (epithelial-mesenchymal transition, EMT) komórki nowotworowe mogą tracić swoje nabłonkowe cechy i nabywać właściwości mezenchymalne. Towarzyszy temu zmiana kształtu komórki, utrata potrzeby stałego kontaktu z innymi komórkami i podłożem oraz wzrost plastyczności.

Komórki nowotworowe wskutek EMT stają się bardziej niezależne. Mogą oddzielić się od grupy innych komórek nowotworowych, utorować sobie drogę przez mikrośrodowisko guza i przekroczyć barierę naczyń krwionośnych. W ten sposób komórki nowotworowe dostają się do krwiobiegu, skąd mogą przedostać się do odległych tkanek i organów, gdzie mogą zapoczątkować proces powstawania przerzutów.

Do tej pory komórki nowotworowe krążące w krwiobiegu były dla badaczy pustym polem. Niewiele wiedzieliśmy o tym, co się z nimi dzieje, w jaki sposób przeżywają i docierają do innego organu, aby w nim tworzyć przerzuty. Wiemy natomiast, że CTCs, które już przeszły EMT, docierając do miejsca przerzutu, odwracają ten proces i na nowo stają się bardziej epitelialne, czyli bardziej nabłonkowe, i dzięki temu mogą łatwiej osiedlać się w nowych miejscach.

Nie oznacza to jednak, że tylko komórki po EMT mogą przerzutować. Podczas moich badań chciałam się dowiedzieć, w jakim stadium EMT znajdują się CTCs izolowane z krwiobiegu, przy czym szczególnie interesowały mnie komórki o fenotypie pośrednim - epitelialno-mezenchymalnym. Według literatury i wcześniejszych badań zespołu to właśnie one często wykazują cechy sprzyjające przeżyciu i agresywnemu zachowaniu.

- Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) zaakceptowała dwie metody do wykrywania krążących komórek nowotworowych, ale nie są one obecnie stosowane do rutynowej diagnostyki chorych na raka piersi. Pierwsza z nich, CellSearch, to metoda, która wykrywa krążące komórki nowotworowe na podstawie obecności markerów epitelialnych -  EpCAM  i cytokeratyn - oraz braku obecności markera komórek krwi - CD45. W tej metodzie pomijane są jednak komórki, które utraciły ekspresję markerów epitelialnych i zyskały cechy mezenchymalne. Podejrzewa się, że to właśnie komórki o tym fenotypie są bardziej odporne na stres, łatwiej unikają kontroli układu immunologicznego i przede wszystkim posiadają cechy, które pomagają im w opuszczeniu guza pierwotnego.

Druga metoda zaakceptowana przez FDA blisko trzy lata temu wykorzystuje różnicę w wielkości komórek nowotworowych i komórek układu immunologicznego we krwi. Należy jednak pamiętać, że nadal potrzebujemy odpowiedniego markera, żeby te CTCs zidentyfikować. Mamy bardzo dobrze zdefiniowane markery epitelialne, czyli nabłonkowe, ale nadal mimo wszystko brakuje markera komórek nowotworowych, które przeszły kompletne EMT. Mam tu na myśli brak markera występującego na powierzchni komórki, który pozwoliłby nam na łatwą identyfikację tych komórek, kiedy jeszcze są żywe. Jest to o tyle istotne, że analiza żywych komórek umożliwia poznanie ich transkryptomu (mRNA), który informuje o tym, jakie geny ulegają ekspresji.

- Wróćmy do tej pierwszej metody. To przypomina trochę poszukiwanie ludzi w garniturach, którzy zdjęli marynarki.

- Każda komórka posiada swój garnitur charakterystycznych cech. Nazywamy go fenotypem. W przypadku komórek nowotworowych raka piersi wyróżniamy fenotyp epitelialny lub mezenchymalny, ale nie jest to podział zerojedynkowy.

W swoich badaniach oznaczałam także fenotyp pośredni - epitelialno-mezenchymalny. Okazuje się, że komórki o tym fenotypie, pomimo zachowania epitelialności, wykazują cechy wskazujące na ich agresywność, charakterystyczną dla komórek o fenotypie mezenchymalnym. Heterogenność komórek nowotworowych o różnych fenotypach i właściwościach jest tak naprawdę największym wyzwaniem, szukamy bowiem bardzo różnych komórek o unikalnej charakterystyce, które mogły ją zmienić, opuszczając guz pierwotny i trafiając do krwiobiegu.

Metoda CellSearch pozwala wykrywać jedynie te komórki, które zachowały nabłonkowy „strój”, czyli cechy typowe dla komórek nabłonkowych. W praktyce oznacza to, że wykrywana jest tylko część CTCs. Należy jednak pamiętać, że w trakcie swojej „podróży” komórki nowotworowe mogą zmieniać swój fenotyp, czego rezultatem jest też zmiana sposobu funkcjonowania. Zmiana ta nie zawsze musi wynikać z powstawania kolejnych mutacji. Bardzo często jest to efekt adaptacji do zmieniającego się środowiska. Komórka nie musi modyfikować swojego genomu - wystarczy, że zmieni zestaw białek, które produkuje, dostosowując się do aktualnych warunków.

- Krążące komórki nowotworowe potrafią się „wyciszyć” i ukryć.

- Pacjentka czuje się dobrze, leczenie wydaje się skuteczne, lekarze zakładają, że choroba została opanowana, tymczasem pojedyncze komórki nowotworowe mogą przejść w stan uśpienia (ang. dormancy). Takie komórki mogą przebywać w danym narządzie lub tkance przez długi czas, nie dzielić się i nie dawać żadnych objawów. Czekają na sprzyjające warunki, aby ponownie się aktywować, zacząć się dzielić, a w efekcie doprowadzić do powstania przerzutów. Pojedyncze komórki nowotworowe w niszy przerzutowej są niewidoczne dla standardowych metod diagnostycznych o ograniczonej czułości. Takie ogniska są wykrywane dopiero, gdy masa komórek osiągnie odpowiednią wielkość. Właśnie dlatego tak istotne jest zrozumienie tego, co dzieje się pomiędzy opuszczeniem przez komórki nowotworowe guza pierwotnego a pojawieniem się przerzutów. W swoich badaniach chciałam się skupić na pojedynczych krążących komórkach nowotworowych, bo to właśnie one powodują rozsiew nowotworu. Zależało mi na zrozumieniu, co czyni je wyjątkowymi: jakie cechy pozwalają im opuścić guz, przetrwać w bardzo nieprzyjaznym środowisku i potencjalnie zapoczątkować nową zmianę nowotworową w innym miejscu.

Dopiero w kolejnym etapie możliwe jest ich dokładne profilowanie i próba identyfikacji charakterystycznych markerów, czyli cech, które pozwoliłyby je wykrywać - czy to we krwi, czy być może w tkankach.

Samo profilowanie krążących komórek nowotworowych może natomiast już teraz pomóc w odkrywaniu nowych potencjalnych celów terapeutycznych. W moich badaniach, mimo bardzo ograniczonej liczby komórek spełniających kryteria jakościowe, udało się zaobserwować, że w komórkach nowotworowych o cechach mezenchymalnych proces powstawania białek jest ograniczony. Jest to mechanizm, który zapewnia im absolutne minimum potrzebne do przetrwania i daje szansę na dalszą ekspansję w przyszłości. Być może właśnie zakłócenie proprzeżyciowych szlaków mogłoby w przyszłości stać się podstawą terapii celowanej. Jest to kluczowe, aby leczenie było jak najbardziej precyzyjne i jednocześnie jak najmniej obciążające dla całego organizmu.

- Jak lekarze onkolodzy podchodzą do wyników Pani badań? Jak reagują na informację, że u znacznej części pacjentek wykrywa się krążące komórki nowotworowe (CTC)?

- Moje badania obejmowały dość niewielką grupę chorych w niezaawansowanym stadium choroby - było ich nieco ponad sto. Aby wyciągać jednoznaczne wnioski kliniczne, potrzebne są znacznie większe badania, najlepiej wieloośrodkowe, obejmujące setki lub tysiące chorych. Znane są już pierwsze wyniki dużego badania klinicznego STIC CTC, które objęło kilkaset pacjentek. Sprawdzano w nim, czy dobór terapii na podstawie liczby krążących komórek nowotworowych we krwi może konkurować z obecnie stosowanymi kryteriami oceny chorej. Prace opublikowane na przestrzeni ostatnich lat wskazują, że oznaczanie liczby CTCs we krwi dostarcza informacji prognostycznej porównywalnej z dotychczas stosowanymi kryteriami diagnostycznymi.

W tym kontekście moje badania są raczej niewielką „cegiełką” dołożoną do znacznie większej układanki. Ich wartość polega między innymi na tym, że zarówno moje wyniki, jak i wyniki innych zespołów badawczych są ogólnodostępne. Dzięki temu można je łączyć, analizować na większych zbiorach danych i sprawdzać, jakie wnioski pojawiają się przy zwiększeniu liczby analizowanych komórek czy chorych. Na obecnym etapie to właśnie jest moja rola - dostarczenie danych, które w przyszłości mogą zostać wykorzystane w większych projektach. Trzeba podkreślić, że są to badania podstawowe, a nie kliniczne. To jednak właśnie na podstawie takich badań rozpoczyna się później projektowanie dużych badań klinicznych, które mogą realnie przełożyć się na praktykę medyczną.

Jeśli natomiast chodzi o interpretację wyników, nie podchodziłabym do nich w sposób zerojedynkowy. Wszystkie komórki nowotworowe - niezależnie od fenotypu - które znajdą się w krwiobiegu, stanowią potencjalne zagrożenie. W analizach opartych jedynie na obecności CTCs faktycznie obserwowaliśmy, że ich wykrycie koreluje z gorszymi cechami kliniczno-patologicznymi nowotworu. Dopiero analiza na poziomie pojedynczych komórek pokazała coś więcej: komórki, które nabyły cechy mezenchymalne - zarówno czysto mezenchymalne, jak i o fenotypie pośrednim epitelialno-mezenchymalnym - wchodzą w stan pro-przeżyciowy. Są one niejako „nastawione” na przetrwanie w trudnych warunkach. Mają one również swoje ograniczenia. Komórkom o silnie mezenchymalnych cechach trudniej jest zapoczątkować przerzut, ponieważ, aby to zrobić, muszą przejść z trybu proprzeżyciowego do trybu aktywnej proliferacji, czyli na tryb intensywnego namnażania. Samo wydostanie się z guza i przetrwanie w krwiobiegu nie wystarcza. Kluczowe jest to, czy komórka potrafi „doprowadzić proces do końca”, czyli rozpocząć tworzenie nowego ogniska nowotworowego. Aby tak się stało, musi przystosować się do zupełnie nowego środowiska. W nowej tkance czekają na nią liczne wyzwania: obecność komórek układu odpornościowego, inne warunki metaboliczne i sygnały środowiskowe niż w guzie pierwotnym. Tylko niewielka część komórek jest w stanie się do tego przystosować i dać początek przerzutowi odległemu.

- Czy kontynuuje Pani badania nad CTCs?

- Dr hab. Aleksandra Markiewicz, promotorka pomocnicza mojego doktoratu, prowadzi dalsze intensywne badania w tym obszarze. Kontynuuje badania nad krążącymi komórkami nowotworowymi, poszerzając je nie tylko o analizę transkryptomu, którą zajmowałam się ja, ale również o analizę genomu. Równolegle składane są kolejne wnioski grantowe, a badania są systematycznie rozwijane

- Czym się teraz Pani zajmuje?

- Obecnie zajmuję się badaniem zjawiska pamięci transkrypcyjnej. To proces, w którym komórka potraktowana określonym czynnikiem „zapamiętuje” ten sygnał, a przy kolejnej z nim styczności - odpowiada znacznie silniejszą ekspresji genów na poziomie mRNA i białka. Moim zadaniem jest zbadanie, co powoduje powstanie tej pamięci i jakie są jej mechanizmy.

Pod koniec ubiegłego roku udało mi się zdobyć grant w konkursie NCN MINIATURA, w ramach którego badam efekt kumulatywny pamięci transkrypcyjnej w zależności od liczby ekspozycji na dany bodziec. W moich badaniach jest nim interferon gamma - białko odgrywające kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej organizmu. Analizuję, w jaki sposób wielokrotna stymulacja interferonem wpływa na zachowanie komórek.

Badania są już na zaawansowanym etapie i w przyszłości chciałabym spróbować zastosować ich wyniki w terapii nowotworów. Mam również pomysł, aby w przyszłości połączyć te badania z tematyką mojej pracy doktorskiej, czyli krążącymi komórkami nowotworowymi. To jeszcze koncepcja wymagająca dalszego dopracowania. Jestem dopiero rok po obronie doktoratu i czuję, że potrzebuję jeszcze czasu, aby się uczyć, obserwować i nabierać naukowej dojrzałości. Mam jednak nadzieję, że w przyszłości wyniki tej pracy będą nie tylko opublikowane, ale też będą wartościowe dla nowych rozwiązań w praktyce klinicznej.

Rozprawa doktorska dr Justyny Topa z Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii UG i GUMed pt. „Kliniczne i biologiczne znaczenie krążących komórek nowotworowych o różnych fenotypach epitelialno-mezenchymalnych u chorych na raka piersi” została przygotowana pod kierunkiem prof. dr hab. Anny Żaczek oraz dr hab. Aleksandry Markiewicz.

Rozmawiała: Urszula Abucewicz, CKiP UG